Contrairement au séquençage Sanger, qui se limite à un seul fragment d'ADN, le séquençage haut débit permet l'acquisition simultanée de données relatives à des millions de fragments d'ADN constituant ce que l'on nomme une librairie.
En tant que technologie hautement évolutive, la technologie NGS peut être utilisée pour séquencer le matériel génétique de n'importe quel organisme :
- Séquençage de génomes encore non référencés (Séquençage De novo)
- Re-séquençage de génomes référencés, afin de trouver de nouveaux variants génétiques
- Analyse de transcrits : RNA-Seq
- Identification de mutations ponctuelles (SNPs), d'insertions ou de délétions de fragments d'ADN
- Détection de différents organismes (biodiversité) présents dans un échantillon donné (étude du microbiome intestinal par exemple) par l'analyse de séquences cibles
- Détermination des sites de méthylation de l'ADN
- Étude des interactions ADN/ARN - protéines ...
-
Technologie 454 ou pyroséquençage chez Roche
-
Séquençage par ligation chez Applied Biosystems
-
Séquençage par synthèse chez Illumina.
La technologie Illumina est basée sur le séquençage base par base de clusters. Les clusters sont des regroupements de fragments d'ADN identiques positionnés les uns à proximité des autres sur un support solide.
Le séquençage sur appareil Illumina se déroule de la manière suivante :
- Préparation de librairie(s) : elle consiste soit en une lyse chimique, enzymatique ou mécanique de l'ADN (ADNc ou ADNg) en fragments de taille réduite et homogène aux extrémités desquelles seront fixées de petites séquences spécifiques appelées étiquettes (Tag), soit par la réalisation d'une amplification ciblée de fragments à l'aide d'amorces complémentaires portant les étiquettes. Plus de détails sur la préparation de librairies.
- Amplification par PCR de chacun des constituants de la librairie à partir des séquences complémentaires des étiquettes fixées sur le support solide pour générer les clusters. Chaque cluster comporte de 1 000 à 5 000 molécules identiques. Suivant le support utilisé, plusieurs dizaines de millions de clusters peuvent se former sur le support.
- Détermination de la séquence par incorporation de dNTPs fluorescents. La lecture se fait base par base en "single read" à partir d'une étiquette. Il est également possible de lire les fragments en "Paired-end read", c'est à dire dans les deux sens à partir de deux étiquettes différentes.
Les résultats du séquençage NGS sont caractérisés par deux notions importantes :
- La couverture : pourcentage de la librairie qui est séquencée
- La profondeur : nombre de fois que chaque base est lue.
Ces grandeurs sont généralement définies en amont et sont à moduler en fonction du projet. Par exemple, pour du séquençage De novo, une couverture et une profondeur importantes seront conseillées, tandis que pour du séquençage d'amplicons, une profondeur élevée sera privilégiée.
BIOMNIGENE vous accompagne dans vos projets de séquençage haut débit.
Formés par le leader mondial du séquençage Illumina, nos ingénieurs vous proposeront l'approche expérimentale la plus adaptée à vos objectifs. Notre laboratoire est équipé de deux appareils de seconde génération Illumina : le MiSeq et l'iSeq100 qui permettent l'analyse du génome ou du transcriptome de microorganismes, l'étude de microbiotes, le génotypage d'animaux....
Les données brutes collectées ainsi que le compte-rendu de l'expérience vous seront retournés en format FastQ sur clé USB.
Certaines analyses bioinformatiques peuvent être réalisées par nos soins telles que la détermination de variants ou la caractérisation d'un microbiome. Pour d'autres analyses, nous vous redirigerons vers l'un de nos partenaires.
