Cette technique de séquençage de l'ADN, également appelée "séquençage par terminaison de chaîne" ou "séquençage déoxy", a été développée par le biochimiste Frederick SANGER en 1977 et comporte deux étapes :

1. Une PCR spécifique : elle diffère d’une PCR classique par l'utilisation d'une seule amorce (au lieu de deux) et par l'incorporation de nucléotides chimiquement modifiés bloquant l'élongation du fragment, les didéoxynucléotides (ddNTPs). La présence d'une seule amorce empêche l'amplification du fragment à séquencer. Les ddNTPs, quant à eux, permettent d'obtenir des fragments de longueurs différentes. Les concentrations en ddNTPs utilisées permettent statistiquement de synthétiser toutes les longueurs de fragments. Dans la méthode de base, 4 réactions étaient réalisées simultanément, chacune comprenant un ddNTP particulier (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP). De nos jours, chacun des 4 ddNTPs est porteur d'un fluorochrome spécifique, ce qui permet un marquage des fragments d'ADN à leurs extrémités lors d'une réaction unique.
2. Une séparation des fragments : dans la méthode originelle, les produits de chaque réaction étaient séparés par électrophorèse sur une piste définie d'un gel d'agarose. Les fragments étant séparés suivant leur longueur, il suffisait de "lire" les bandes présentes sur le gel pour déterminer la séquence. De nos jours, les fragments d'ADN obtenus sont soumis à une électrophorèse capillaire durant laquelle le signal fluorescent émis par chaque ddNTP marqué est analysé par informatique. Le traitement des données permet ainsi de déterminer l'identité du nucléotide et de reconstituer la séquence de la matrice d'ADN d'origine.