Vos projets de recherche nécessitent de :
- Quantifier l'expression d'un gène
- Détecter et estimer la quantité relative d'un pathogène, un virus ...
- Génotyper à partir de SNPs
- Détecter et déterminer le nombre de copies d'un gène
- Contrôler la qualité de vos cocultures et valider un test de production.
La PCR en temps réel ou PCR quantitative (qPCR) est une des techniques les plus adaptées pour répondre à ces besoins : dérivée de la PCR, elle permet de détecter, caractériser et quantifier les acides nucléiques pour de nombreuses applications.
La qPCR est généralement réalisée à partir d'ADN, mais pour certaines applications spécifiques telles que l'expression de gènes, l'ARN sera utilisé comme support de départ, nous parlons alors de RT-qPCR (Reverse Transcription quantitative PCR).
Plus précisément, la PCR en temps réel diffère de la PCR classique par l'utilisation d'un système de marquage permettant de suivre la progression de la réaction. Les données recueillies à chaque cycle sont analysées informatiquement pour caractériser un ou plusieurs gènes (présence ou absence, niveau d'expression ...).
La qPCR est une PCR pendant laquelle il est possible, grâce à un marquage fluorescent, de suivre l'amplification de fragment d’ADN en continu. L'intensité de la fluorescence est mesurée à chaque cycle, elle reflète la quantité de produits amplifiés au cours du temps.
Comme le montre le graphique (fluorescence = f(nombre de cycles)) reporté ci-dessous, la fluorescence et donc le nombre de fragments amplifiés augmentent en fonction du nombre de cycles. La courbe obtenue montre 3 phases :
- Phase de bruit de fond : Le nombre de fragments amplifiés est trop faible pour permettre à la fluorescence émise de dépasser le seuil de détection, le signal reste indétectable
- Phase exponentielle : La quantité de fragments amplifiés augmentent de façon exponentielle (le nombre de fragments double à chaque cycle) permettant l'émission d'un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l’appareil. Sur une représentation logarithmique, cette augmentation sera visualisée sous la forme d'une droite
- Phase de plateau (ou de saturation) : La mélange réactionnel s'appauvrit en certains éléments nécessaires à l'amplification ne permettant plus la croissance exponentielle. Nous observons alors une stagnation de la quantité de fluorescence et du nombre de copies du fragment amplifié.
Plus le nombre de copies du gène cible sera élevé à l'origine, plus le nombre de cycles requis pour que l'intensité de la fluorescence dépasse significativement le seuil de détection sera faible. Ce nombre de cycles situé au début de la phase exponentielle est appelé Ct (Cycle Threshold) et sert de base à l'analyse des résultats de la qPCR.
La PCR en temps réel diffère donc des méthodes en point final puisque les données collectées après l'apparition du Ct ne revêtent pas un caractère essentiel pour l'analyse.
Cette technique présente de nombreux avantages dus à la variété des chimies disponibles.
Equipé d'un appareil QuantStudio 3 Applied biosystem, nous sommes en mesure de vous proposer deux chimies différentes pour vos qPCR :
- L'utilisation du SYBR® Green : fluorophore émettant lorsqu'il est incorporé dans une molécule d'ADN double brin
- L'utilisation de sondes marquées TaqMan® : spécifiques des gènes à amplifier, ces sondes sont dégradées lors de la phase d'élongation libérant ainsi la fluorescence.
Biomnigene est en mesure de vous conseiller sur le choix des séquences pouvant être analysées simultanément, la chimie à utiliser, le design des amorces et/ou des sondes, ou encore la mise au point du protocole expérimental pour la réalisation de votre projet.
